החיידקים הם מיקרואורגניזמים חד תאיים. במשך שנים למדו במעבדות על חיידקים שגידלו אותם בתוך קרקע מזון נוזלי או פלטות פטרי. התייחסו אליהם כאל יצורים טפילים החיים בתמיסה ביחידות או שהם בונים מושבות קטנות. בשנות השבעים של המאה ה-20 הבחין המיקרוביולוג William Costerton מאוניברסיטת מונטנה, שרוב החיידקים החיים במקווי מים מאורגנים במבנה קרומי רב תאי, המכונה ביופילם.מחקר מתקדם של קרומים רב תאיים אלה התחיל בסוף שנות השמונים של המאה ה-20.הביופילם הם צברים של מיקרואורגניזמים, בעיקר חיידקים, הנצמדים למשטח קשיח חי או דומם, ומוקפים על ידי חומר שהם מפרישים ושמגן עליהם. החיידקים שבקרום מהווים מערכת ביולוגית מורכבת, שבה הם חיים כמעט כיצור רב תאי, ולא כמושבה הבנויה מתאים בודדים (1).ביופילם נוצרים על משטחים המוקפים בנוזל, כגון, השיניים והחניכיים, שעליהם נוצר הרובד של השן (dental plaque), על קרומים ריריים בסינוסים ובדרכי הנשימה, על פצעים שאינם נרפאים.הם נוצרים גם על מתכות ופלסטיק, ועלולים להתיישב על מתקנים רפואיים, כגון, עדשות מגע, שסתומים מלאכותיים המושתלים בלב, שיניים מושתלות, מפרקים, וכן גם על צנורות מים, סלעים המצויים בתוך מים, צנורות ביוב.ביופילם מכילים לפעמים רק מין אחד של חיידקים. במקרים אחרים הם מכילים מינים אחדים של חיידקים, או תערובת של חיידקים עם אצות או פטריות.החיידקים משתנים כשהם מצטרפים לקהילה שבקרום. דופן התא שלהם משתנה כך שהוא יוכל להאחז במשטח שהוא נצמד אליו, וחל שינוי בהרכב החומרים שהחיידק מייצר (2).הביופילם מטריד את עולם הרפואה כי צורת החיים הקהילתית מספקת הגנה לחיידקים. הם נעשים עמידים לפעילות של מערכת החיסון, לאנטיביוטיקה ולתרופות אחרות, ומקשים על ריפוי ממחלות זיהומיות.
כיצד נוצרים הביופילם?
בשלב ראשון נוצרת שכבה של חומר על גבי המשטח. נוזלי הגוף, מים במקווי מים שונים, ביוב, מים רדודים, מכילים כולם פוליסכרידים, חלבונים וחומרים נוספים ששוקעים ויוצרים כעין ציפוי על גבי משטחים. משטח מצופה כזה הוא מקום מתאים להתיישבות של חיידקים.חיידקים הצפים בנוזל, הנקראים גם חיידקים של הפלנקטון, נצמדים למשטח.ישנם חיידקים הנצמדים בקלות רבה, כגון, אלה שיש להם על דופן התא גופיפים הנקראים pilli העוזרים להם להצמד למשטחים. החיידקים שנצמדו מפרישים חומר דביק שעוזר להם להתחבר זה לזה ולמשטח הקשיח. החומר המופרש נקרא Extracellular Polymeric Substance- EPS. הוא מכיל פולימרים של פוליסכרידים, חלבונים ולעיתים קרובות גם DNA.הקרום גדל בהדרגה על ידי חיידקים חדשים המצטרפים, ועל ידי התרבות של אלה שכבר נקשרו, ומתקבל ביופילם בוגר.חיידקים שמשתחררים מהקרום מתחילים בייצור של קרום חדש. כאשר נוצר קרום כזה במקומות שונים בגוף החיידקים נעשים עמידים בפני מערכת החיסון של הפונדקאי. הם מקשים על התאים הלבנים לבלוע אותם, והם מוגנים בפני האנזימים המצויים בתאים הלבנים, והמשתחררים מהם כדי לתקוף את החיידקים.השלב של פיזור של חיידקים מתוך הביופילם הוא שלב חשוב בתוך מחזור החיים (3). הוא מאפשר התיישבות על משטחים חדשים וייצור של קרומים נוספים. אנזימים מהחומר החוץ תאי כנראה ממלאים תפקיד בפיזור של הביופילם (3).
תקשורת בין חיידקים בביופילם
קרומי החידקים פועלים כחברה מסודרת. בכמה קרומים מצאו תעלות מים, שדרכן מעבירים מזון ומולקולות איתות. החיידקים שבתוך הביופילם יכולים לתקשר ביניהם. ישנם חיידקים המפרישים לסביבה acyl homoserine lactones- AHL המשמשים כמולקולות איתות.מולקולות AHL מאשפרות לחיידקים לחוש את אלה שנמצאים מסביבם. תופעה זו נקראת חישת הקוורום- Quorum sensing. היא מפעילה גנים האחראים לחלבונים הכרחיים לחיים כחברה, ומווסתת את המעבר ממצב יחידאי למצב חברתי.חישת הקוורום הכרחית ליצירת הביופילם. היא מושפעת מתנאי הסביבה, וביניהם מריכוז הברזל. בתנאים של מחסור בברזל ישנה עלייה ביצירת האותות של חישת הקוורום. יש קשר בין הברזל לבין התקשורת בין חיידקים. חישת הקוורום אם כך תלויה לא רק בצפיפות החיידקים אלא גם בגורמים מטבוליים (4).החשיבות של חישת הקוורום לביופילם הביאה את החוקרים לחפש מולקולות הדומות ל-AHL, שתוכלנה לשמש כחומר "אנטי ביופילמי". מחפשים מולקולות שנקשרות לקולטנים של מולקולות האיתות, אך אינן מעבירות את האות ההכרחי.החוקרים סטפן קיילברג, S. Kjelleberg ופיטר שטיינברג P. Steinberg מאוסטרליה מצאו שהאצה האדומית Delisia pulchra מייצרת חומרים הדומים למולקולות AHL. הם מציעים להשתמש באצה כדי למנוע היווצרות של ביופילם.
ביופילם ומחלות זיהומיות
ביופילם נוצרים על קרומים בגוף, ומקשים על מערכת החיסון לתקוף אותם. הם קשורים למחלות זיהומיות רבות, ולעמידות של חיידקים לאנטיביוטיקה. (5).נוכחותם הוכחה על עדשות מגע (6), בסינוסיטיס, בזיהומים בדרכי השתן, בזיהומים של האוזן התיכונה, בדלקות חניכיים (4). התיישבות חיידקים על קרום הלב במקרים של אנדוקרדיטיס היא נדירה יותר אבל מסוכנת מאד. ביופילם קשורים גם לציסטיס פיברוזיס, ולזיהום של מפרקים מושתלים, קוצבי לב ושסתומי לב מלאכותיים (7).מצאו גם שחיידקים בביופילם מפריעים לריפוי של פצעים בעזרת משחות אנטיביטיות בטיפול חיצוני (8).החיידקים השכיחים ביותר שנמצאו על מתקנים ומכשירים רפואיים הם סטפילוקוקים, בעיקר S. aureus, S. epidermitis ואחריהם פסוידומונס P. aeruginosa, חיידק שכיח בזיהומים בדרכי השתן (4). התיישבות הביופילם על מכשירים ומתקנים מושתלים הביא לכינוי של מחלה זיהומית חדשה, chronic polymer-associated infection (4).סטפילוקוקים הם חלק מהפלורה הנורמלית של העור, והביופילם שהם יוצרים גורמים לתופעה של פצעים שאינם נרפאים, או שהם מגלידים ונפתחים מחדש (4).ייצור של ביופילם יכל להחשב כגורם וירולנטי, המאפשר לחיידקים לגרום לזיהום ולהתפשט על אף המלחמה של מערכת החיסון ושל הטיפול האנטיביוטי (4).המדע עוסק בחיפוש אחר חומרים שיעכבו התפתחות של קרומי חיידקים ויפגעו בקרומים קיימים. האדם למד להכיר את קרומי החיידקים רק בעשרות השנים האחרונות, אבל התופעה היתה קיימת כבר בתקופות קדומות מאד. על מאובנים שנשארו מלפני מיליוני שנים מצאו ביופילם שכיסה אותם. מכאן שצורות החיים הקדומות נאלצו להתמודד עם התיישבות של חיידקים, ולמצוא את הדרך למנוע אותה. הצמחים שהופיעו על פני כדור הארץ לפני שנים רבות היו צריכים לפתח מרכיבים נגד התיישבות חיידקים.רוב המחקרים שנעשו על תכונות אנטי בקטריאליות של צמחים עסקו בצמח כבקטריוסטטי או בקטריוצידי. הצורך לעכב התיישבות של חיידקים וייצור של ביופילם פותח ענף חדש של מחקר, שרק מעטים עסקו בו עד עכשיו.
צמחי מרפא המעכבים ביופילם
צמחים המעכבים ייצור ביופילם של סטפילוקוקים.באיטליה נערך מחקר על סטפילוקוקים עמידים ל-methicillin .סטפילוקוקוס זהוב, Stapyilococcus aureua, הוא חיידק שכיח מאד בזיהומים בעור של בני אדם ובעלי חיים. בשנים האחרונות מרבים להופיע זנים עמידים לפניצילין, טטרה-ציקלין, מתיצילון וואנקומיצין (9). Methicillin resistant S. aureus-MRSA הופכים להיות סכנה לבריאות הציבור, והם מעורבים בזיהומים בבתי חולים (9). הם מייצרים ביופילם על פצעים בעור ועל מיתקנים בבתי החולים.חיידקים המאורגנים בביופילם גדלים לאט, ובתוך הביופילם יש מובלעות של חיידקים רדומים, המאפשרים שיקום של הביופילם אם תהיה פגיעה בחיידקים המצויים בשכבות החיצוניות. התארגנות זאת מוסיפה לעמידות שלהם לאנטיביוטיקה, מפני שהתרופות האנטיביוטיות יעילות בדרך כלל נגד חיידקים פעילים בלבד. הם פוגעים בתהליכים חיוניים או בהתרבות של החיידק (9).במחקר שנערך באיטליה (9) נבדקו 168 צמחים לפעילות אנטי בקטריאלית ולפעילות המעכבת ייצור של ביופילם. מתוכם נמצא עיכוב של ביופילם על ידי 10 מהצמחים שנבדקו.הצמחים הם: Lonicera alpigena, Castanea sativa, Juglans regia, Ballota nigraRosmarinus officinalis, Leopoldia carmosa, Malva sylbestris,Cyclamen hederifolium, Rosa canina, Rubus ulmifoliusהעיכוב היה משמעותי במיוחד, והתבטא בתלות בריכוז הצמח אצל 5 צמחים:Arundo donax, Ballota nigra, Leopoldia comosa, Marrubium vulgareRubus ulmifolius Arundo donax עבקנה שכיחמשפחת הדגניים Poaceaeהצמח עבקנה שכיח גדל בר בארץ, ליד מקוי מים, בגדות נחלים ובבתי גידול לחים.
באיטליה משתמשים בצמח לבניית כלים מוסיקליים ולייצור צלולוז תעשייתי. בדרום איטליה משתמשים בו גם לתמיכה בגפנים בכרם.בקנה השורש יש לקטין, שהראו שהוא מעכב התחלקות של תאים סרטניים. קנה השורש עשיר באלקלואידים, כולל bufotenidine.במפרקים של הצמח יש קרום לבן בנוי מהמיצלולוזה. המיצוי המימי של המפרקים מעכב באופן משמעותי ייצור של ביופילם של סטפילוקוק MRSA, וגם הורס ביופילם קיים (9).הפעילות תלויה בריכוז הצמח. בעבר נהגו לכסות פציעות ושריטות עם הקרום שבמפרק הצמח. כנראה שהם ידעו באופן ניסיוני שהם מזרזים את הריפוי.
Ballota nigra בלוטה שחורה
משפחה: שפתניים, Lamiaceaeחליטות של נוף הצמח משמשות בדרום איטליה לשטיפה של פריחות בעור, וכן להגברת זרימה של דם.מיצוי מימי של נוף הצמח, דומה לזה שהשתמשו בו ברפואה המסורתית הראה עיכוב משמעותי של ייצור ביופילם ושל היצמדות- adherence . הצמח הוא מעכב חלש של סטפילוקוקים, והעיכוב מתבטא בעיקר בייצור וגידול של הביופלם.
Juglans regia אגוז המלך
משפחה: Juglanaceae
באיטליה נהגו להשתמש בעלים כדי להגן על גבינות מפני טפילים. בתורכיה נהגו להשתמש בעלים לטיפול ברוימטיזם, בכאב שיניים, טחורים, זיהומים פטרייתיים, שיעול ואקסמה.מירתח מגזע העץ משמש לטיפול בכאב שיניים. עלים טריים משמשים בטיפול חיצוני להפחית נפיחות במקרים של דלקות ורידים (9). פירות הבוסר משמשים כצבע לשיער.מיצוי אלכוהולי של פרי הבוסר עיכב היצמדות וייצור של ביופילם. הפרי עשיר בפנולים, כולל נפתוקינונים, טאנינים ופלבונואידים שהם כנראה לפעילות האנטי בקטריאלית שלו.Commission E מאשרת שימוש בעלים לטיפול בדלקות בעור (9).
Leopoldia comosa– מצילות מצויצות
משפחה: שושניים, Liliaceae צמח בר נפוץ בארץ. גדל על אדמות מעובדות, צומח עשבוני ובתות.הבצל משמש ברפואה המסורתית באיטליה לטיפול בכאב שיניים. מיצויים מהבצל הם אנטי אוקסידנטים in vitro. המיצוי המימי והאלכוהלי של הבצל מעכבים יעילים של ייצור והתפתחות ביופילם של סטפילוקוקוס עמיד לאנטיביוטיקה, וכן עיכוב של היצמדות.
Marrubium vulgare מרוביום מצוי
משפחה: שפתניים, Lamiaceae
צמח מקובל מאד ברפואה המסורתית של דרום איטליה. נוהגים להגיד שהוא הורס כל מחלה. משתמשים בו לטיפול בפרונקלים, כוויות, זיהומים פטרייתיים, זיהומים בעור,דרמטיטיס, מחלות זיהומיות אצל חיות, גסטרירטיס.מירתח מהעלים משמש לשטיפות במקרים של זיהומים בעור.מיצוי אלכוהולי של השורש עיכב ביעילות רבה היצמדות של ביופילם למשטח. הוא היה פחות יעיל לעיכוב ייצור של ביופילם.
מקורות
1. Stoodley P. Costerton JW. Sauer K. Biofilms as complex differentiated communities. Annual Reviews Microbiology, 2002, 56: 187-209.2. An D. Parsek MR. The promise and peril of transcriptional profiling in biofilm communities Current Opinion in Microbiology, 2007, 10: 292-296.3. Kaplan JB. Ramasubbu N. Fine N. Detachment of Actinobacillus actinomycetemcomitans biofilm cells by an endogenous beta-hexosaminidase activity. J. Bacteriology, 2003, 185: 4693-4698.4. Stoodley LH. Costerton JW. Stoodley P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectous diseases. sNature Reviews, Microbiology, 2004, Vol 2: 95-108.5. Research on microbial biofilms, NIH, Nationa Heart, Lung and Blood Institute, 2002: 12-20.6. Imamura Y. Chadra J. Mukherjee PK. et al. Fusarium and Candida albicans biofilms on soft contact lenses: model development, influence of lens type, and susceptibility to lens care soliutions. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2008, 52: 171-182.7. Parsek MR. Singh PK. Bacterial biofilms: an emerging link to disease pathogenesis. Annual Review of Microbiology , 2003, 57: 677-701.8. Davis SC. Ricotti C. Cazzaniga A. et al. Microscopic and physiologic evidence for biofilm-associated wound colonization in vivo, Wound Repair and Regeneration, 2008, 16: 1:23-29.9. Cassandra L.Q. Lisa RW. Pantuso T. Effects of extracts from Italian medicinal plants on planktonic growth. Biofilm formation and adherence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Ethnopharmacology 2008, 13: 418-428.
צמחים נוספים שהוכחו כמעכבים של ביופילם
מחקר שפורסם לאחרונה הראה שהשורשים של מין של פטל Rubus ulmifolius, מעכבים ייצור של ביופילם על ידי החיידק Staphylococcus aureus.הצמח עשיר בנגזרות של חומצה אלגית, שהם אחראים לעכוב של הביופילם. העיכוב התקבל עם ריכוז נמוך של מיצוי השורש 50-200 מיקרוגרם ל-מ"ל. הריכוז שעיכב גידול של החיידק היה 530-1040 מיקרוגרם ל-מ"ל.Quave CL. Estevez-Carmona M. Compadre CM. et al. Ellagic acid Derivatives from Rubus ulmifolius inhibit Staphylococcus aureus Biofilm Formation and Improve Response to Antibodies. PLoS ONE, 2012, 7(1): e28737.dot:10.1371/journal.pone.0028737.
עיכוב של חישת-קווארום על ידי צמחים
Pseudomonas aeruginosa הוא חיידק וירולנטי במקרים שתפקוד מערכת החיסון אינו תקין. הוא מעורב לעתים קרובות בזיהומים בבתי חולים.הביטוי של הגורמים הוירולנטיים שלו מווסת על ידי מערכת חישת הקווארום, שמאפשרת קשר בתוך אוכלוסיה של חיידקים, על ידי מולקולות איתות ורצפטורים. החיידק מפריש חומרים המעודדים ייצור של מולקולות איתות, שמתפזרות בסביבה ופועלות על רצפטורים.חישת הקווארום חיונית להתפתחות קרומים של חיידקים, שהופכים להיות עמידים לאנטיביוטיקה ולפעילות של מערכת החיסון של הפונדקאי.במחקר הנוכחי מדווחים ששה צמחים מדרום פלורידה שהוכחו כמעכבים של חישת הקווארום.הצמחים הם: Conocarpus erectus, Chamaesce hyperricifolia,Callistemon viminalis, Butcida buceras, Tetrazygia bicloeQuercus virginianaהראו איך הצמחים האלה הפחיתו את הוירולנטיות של הביופילם של הפסוידומונס. Adonizio A. Kong KF. Kalai M. Inhibition of Quorum Sensing-Ccontrolled Virulence Factor Productim in Pseudomonas aeruginosa by South Florida Plant Extract. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2008, 198-203. מחקר נוסף שנערך באיטליה הראה עיכוב של ייצור ביופילם של החיידקStaphylococcus epidermidis, על ידי פירות של Aesculus hippocastanumו- Chelidonium majus (נוף הצמח). Artini M. Papa R. Barbato G. et al. Bacterial biofilm formation inhibitory activity revealed for plant derived natural compounds. Bioorganic and Medicinal Chemistry Vol. 20 issue 2 15 January 2012, p.920-926.
עיכוב ייצור של ביופילם של Pseudomonas aeruginosa
הצמחים שנתנו עיכוב של 50% של ייצור הביופילם היו:קליפות של לימון Citrus lemonפירות של אטד סיני Lycium cinensisשורש של ג'ינסנג אמריקאי Panax quinquefolium Cheng K. Anderson D. Dan A. Inhibitory Biofilm Formation of Pseudomonas aeruginosa. Young Scientists Journal 2009, 2;8-13.
השפעה של פוליפנולים על ייצור של ביופילם של חיידקים ועל חישת הקואורום
חיידקים רבים משתמשים במערכות וויסות מתוחכמות, כדי להבטיח שכמה מהתפקודים שלהם יבואו לידי ביטוי רק כשהאוכלוסיה בקרום שהם יצרו תגיע לצפיפות מסוימת.הם משתמשים בתקשורת בין-תאית המבוססת על מולקולות איתות קטנות, הנוצרות על ידי החיידקים, ומאפשרות ביטוי של גנים מווסתים כתלות בצפיפות האוכלוסיה. מכנים את המערכת המווסתת הזאת חישת הקואורום.משערים שהצורה הזאת של וויסות הגנים מאפשרת לחיידקים להישאר בלתי ניראים למערכת החיסון של הפונדקאי, עד שהאוכלוסיה מספיק גדולה ומבוססת.אצל חיידקים גרם-שליליים מולקולות האיתות הנפוצות ביותר הן N-acyl-homoserine lactones (AHLs). הן נוצרות על ידי האנזים AHL synthase. כשצפיפות הביופילם עולה AHL מצטבר במצע הגידול. כשהריכוז מגיע לסף קריטי, המולקולות של AHL נקשרות לרצפטור, שמזרז או מעכב את הביטוי של הגנים המיועדים(1).מאחר והמנגנון הזה של חישת הקואורום פעל אצל פתוגנים רבים מאז הזמן הקדום, יש להניח שיצורים גבוהים יותר פתחו שיטות ומרכיבים שמטרתם להרוס את תהליכי האיתות ואת בניית הביופילם(1).הייצור הראשון שהתגלה ונחקר הוא האצה האוסטרלית הגדולה Delisea pulchra.המחקר הנוכחי מראה שמרכיבים פוליפנוליים, המכילים קבוצות של חומצה גאלית, כגון, epigallocatechin gallate, וכן חומצה אלגית וטאנית מעכבים את חישת הקואורם ומפריעים לייצור הביופילם (1).פוליפנולים נפוצים מאד בעולם הצומח. ריכוז הטאנינים בצמח מגיע לפעמים ל-25% מהחומר היבש. כנראה שהתפקיד שלהם בחיי הצמח גדול וחשוב יותר מכפי שהבנו עד עכשיו.Huber B. Eberl L. Feucht W. et al. Influence of polyphenols in Bacterial biofilm formation and quorum-sensing. Verlag der Zeitschrift fur Naturforschung, 2003, 58c:879-884.
